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內(nèi)源性生物素:生物素是一種維生素,作為一種輔酶參與羧化反應(yīng)。在人體組織中,絕大多數(shù)生物素與線粒體丙酮酸鹽羧化酶相關(guān),因此,富含線粒體的細胞具有豐富的內(nèi)源性生物素,如腎臟、肝臟以及一些腫瘤細胞。如果應(yīng)用生物素/卵白素檢測系統(tǒng),由于卵白素可以和生物素不可逆地強結(jié)合,勢必會造成非特異性染色,熱介導的抗原修復可以顯著“復活”內(nèi)源性生物素,所以更加加劇這種非特異背景染色。解決的方法除了換成非生物素的檢測系統(tǒng)外,還可以用以下簡單的方法封閉內(nèi)源性生物素。首先用蛋清中的卵白素(一個雞蛋清加入到100ml的PBS中)封閉內(nèi)源性生物素,再用5%奶粉作為生物素替代品(5克奶粉加入100ml的PBS/TBS中)來封閉卵白素中未結(jié)合的位點,沖洗后即可加一抗。內(nèi)源性過氧化物酶天酒地 一般紅細胞和嗜中性粒細胞中過氧化物酶含量比較高,會造成非特異性染色。滅活內(nèi)源性過氧化物酶的方法:0.3%-3%H2O2,用PBS(pH7.4)或蒸餾水或甲醇配制。沖洗步驟免疫組化染色步驟中包括多次沖洗過程,任何一步出現(xiàn)沖洗不干凈的問題,都有可能產(chǎn)生背景染色。解決的方法可以在沖洗液中加入吐溫20,一般在1000ml的沖洗液中加入0.2ml的吐溫20即可。鼠單抗用于鼠組織由于小鼠組織中可能含有內(nèi)源性IgG,所以檢測系統(tǒng)就會識別這些抗體,造成非特異性染色。解決的方法要么封閉內(nèi)源性IgG,要么直接使用商品化的Mouse-to-Mouse檢測試劑盒。固定不及時 可以造成蛋白彌散,會產(chǎn)生異位染色。干片孵育的過程中沒有放入濕盒或加入液體過少或孵育時間過長,都會造成局部(尤其是邊緣)干片,應(yīng)該避免。修復過度抗原熱修復(尤其是使用EDTA)有時會造成細胞核異位染色,對于細胞核染色的抗體這種情況應(yīng)通過對照片加以甄別